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Cuantificación de proteínas
Mary Johnson (han at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.115
Date
fecha : 2018-05-26; original version : 2012-02-29
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:115
Resumen

Informe sobre ensayos para cuantificar proteínas y análisis bibliográfico de los ensayos de proteínas basado en 194 publicaciones

English Abstract

A review of protein quantitation assays and a survey about the protein assays based on 194 formal publications.

Introducción

La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados con proteínas en una multitud de temas de investigación. Se han desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en particular. Los métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen métodos tradicionales tales como la medición de la absorbancia a 280 nm, los ensayos de Bradford y el ácido bicinconínico, así como métodos alternativos como el de Lowry o novedosos ensayos desarrollados por los proveedores comerciales. Notmalmente, los proveedores comerciales venden kits bien diseñados y prácticos para cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar proteínas individuales incluyen el ELISA, el Western blot y, más recientemente, la espectrometría de masas, entre otros.

Aquí describimos algunos de los métodos comúnmente utilizados para determinar la concentración de proteínas en solución, resaltando sus utilidades y limitaciones. Es importante mencionarque ninguno de estos ensayos para proteínas son ni específicos para proteínas, lo que significa que componentes no proteicos pueden interferir, ni uniformemente precisos y compatibles con todas las proteínas. Más aún, las modificaciones de las proteínas pueden interferir con la estimación de su concentración en algunos de estos ensayos cuando se comparan con las proteínas no modificadas [1, 2]. Además, algunos ensayos, por ejemplo el de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA), son también eficaces cuando se utilizan para cuantificar péptidos o proteínas encapsulados o ligados a una superficie [3].

Las regulaciones o leyes de las agencias gubernamentales o grupos de comercio pueden requerir métodos específicos para la determinación de proteínas totales. Por ejemplo, la Asociación Internacional de la Industria del Suero (www.serumindustry.org), un grupo comercial de proveedores de suero, recomienda el método de Biuret para la determinación del contenido de proteínas en productos de suero.

Ensayo para cuantificar proteínas

La tabla 1 resume los ensayos para cuantificar proteínas totales más comunes. Es importante evaluar la compatibilidad de cada ensayo con los tipos de muestra, el rango del ensayo, el volumen de muestra y la disponibilidad de un espectrofotómetro adecuado, así como el tiempo y el costo.

ensayo absorción mecanismo límite de detección ventajas desventajas
absorción UV 280 nm absorción de tirosina y triptófano Adulto Buff Stowe Microfibra de Black black de Punto Gorro 0.1-100 ug/ml pequeño volumen de muestra, rápido, económico incompatible con detergentes y agentes desnaturalizantes, alta variabilidad
ácido bicinconínico 562 nm reducción de cobre (Cu2+ a Cu1+), Reacción del BCA con Cu1+ de Stowe Gorro Adulto black de Microfibra Black Buff Punto 20-2000 ug/ml compatible con detergentes y agentes desnaturalizantes, baja variabilidad compatibilidad con agentes reductores baja o nula
Punto Black Buff Microfibra black Adulto Gorro de Stowe de Bradford o azul brillante de Coomassie 470 nm formación de complejo entre el colorante azul brillante de Coomassie y las proteínas 20-2000 ug/ml compatible con agentes reductores, rápido incompatible con detergentes
Lowry 750 nm reducción de cobre por proteínas, reducción de Folin Ciocalteu por el complejo de cobre con proteína 10-1000 ug/ml alta sensibilidad y precisión incompatible con detergentes y agentes reductores, procedimiento largo
Tabla 1. Ensayos comunes para medir proteínas totales.
Absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm (rango: 0.1-100 ug/ml)

Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano confieren a las proteínas su característico espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. La fenilalanina y los puentes disulfuro también pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque ligeramente. Este método es simple y requiere de un volumen de muestra extremadamente pequeño ya que los nuevos espectrofotómetros emplean un sistema de retención de muestra durante la medición. Sin embargo, la muestra proteica debe ser pura y no contener componentes no proteicos con el mismo espectro de absorción, tales como ácidos nucleicos contaminantes [4]. Se debe conocer la secuencia exacta de los aminoácidos de la proteína analizada y calcular el coeficiente de absorción específico de esa proteína previo a la determinación de la concentración en solución [5, 6]. Este método es el más rápido, pero propenso a errores.

Ácido bicinconínico (BCA) o ensayo basado en cobre (rango: 20-2000 ug/ml)

El ensayo de ácido bicinconínico (BCA) fue inventado por Paul K. Smith en 1985 en la compañía Pierce Chemical Company, el mayor distribuidor de este ensayo [7]. Tanto el ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversión del Cu2+ a Cu1+ en condiciones alcalinas. Esta conversión es definida como la reacción de Biuret. Esta reacción es influenciada por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y también por la cadena peptídica.

Figura 1. Representación esquemática del ensayo de BCA.

BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu1+ y en el segundo paso de la reacción dos moléculas de BCA reaccionan con una de ión Cu1+. La cantidad de Cu2+ reducido es función de la concentración de proteínas y puede ser determinada espectrofotométricamente por un cambio en el color de la solución a púrpura, que absorbe a 562 nm. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución y puede ser estimada por comparación con un estándar de proteína conocido, tal como la albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés) [4, 8, 9].

El ensayo de BCA es más tolerante a diversos detergentes iónicos y no iónicos tales como el NP-40, Triton X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de guanidinio, que tienden a interferir con otros ensayos proteicos colorimétricos tales como el Lowry (Tabla 2) [9]. Algunas moléculas químicas como: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) [10], azúcares reductores [11, 12] y lípidos [13] pueden interferir con el ensayo de BCA. El efecto de estas interferencias puede ser eliminado o reducido por varias estrategias tales como la eliminación de la substancia interferente por diálisis, cromatografía de exclusión molecular o, si la concentración de la proteína es lo suficientemente alta, diluyendo la muestra. Recientemente, Reichelt et al (2016) [14], propusieron ajustes simples al método que pueden llevar a mejorías visibles en la exactitud de la medición, especialmente para soluciones complejas de proteínas no purificadas, como medios de cultivo. Utilizan un factor de corrección dado por la medición de BSA agregada a la muestra. Basado en sus estudios la exactitud de la cuantificación de proteínas por BCA podría ser mejorada 5 veces, “llevando la cuantificación de proteínas por BCA a niveles de exactitud comparables a otros métodos mas costosos” [14].

Otro factor que interfiere con la exactitud del ensayo de BCA es la presencia de residuos modificados en las proteínas. En un estudio reciente, Brady y Macnaughtan (2015) [2] evaluaron el impacto de la metilación de lisinas en los ensayos de Bradford y BCA y encontraron que para el ensayo de BCA, la concentración de proteínas en la muestra con proteínas metiladas era sobreestimada de manera consistente.

NP-40 Sacarosa
Emulgen Glicina, pH 2.8
HEPES Glucosa
DTT EDTA
Triton X-100 NaCl
Urea NaOH
Guanidinio HCl Sulfato de Amonio
Acetato de Sodio, pH 5.5 SDS
Tabla 2. Compatibilidad del ensayo de proteínas de BCA.

Thermo Fisher Pierce ha presentado recientemente una nueva versión del clásico ensayo de BCA para proteínas compatible con agentes reductores tales como el ditiotreitol (DTT), el 2-mercaptoetanol (BME), el TCEP y otros agentes reductores de puentes disulfuro [7].

Comparado con otros métodos, el ensayo de BCA es uno de los más sensibles (puede detectar proteínas en concentraciones tan bajas como 5 ug/mL). Tiene menos variabilidad que otros (por ej., el ensayo de Bradford), y puede ser utilizado para medir un amplio rango de concentraciones de proteínas.

Más aún, su sensibilidad puede incrementarse haciendo el ensayo en presencia de nanosensores plasmónicos como en el ensayo de SPR-BCA (del inglés, resonancia plasmónica de superficie - BCA) propuesto por Liu et al [15]. Con este ensayo, el límite de detección fue de 3,4 ng/ml y el rango general de trabajo fue de 0.5 a 1000 μg /ml, disminuyendo la concentración de proteínas que puede ser determinada por el método tradicional de BCA.

Ensayo de Bradford o azul brillante de Coomassie (rango: 20-2000 ug/ml)

El ensayo de Bradford, originalmente descripto por la Dr. Marion Bradford en 1976, es una de los métodos más populares para la determinación de la concentración de proteínas. Se basa en la formación de un complejo entre el colorante azul brillante de Coomassie G-250 y las proteínas en solución. El colorante libre existe en cuatro formas iónicas. La forma azul más aniónica se une a proteínas y absorbe a 590 nm. La concentración de proteínas puede ser evaluada determinando la cantidad de colorante en su forma iónica azul y midiendo la absorbancia de la solución a 592 nm utilizando un espectrofotómetro [16]. El colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina [4].

Figura 2. Representación esquemática del ensayo de Bradford.

La mayoría de los investigadores utilizan BSA como estándar proteico ya que es económica y de fácil disponibilidad, pero no siempre es adecuada. De hecho, una de las desventajas de utilizar BSA es que produce una fuerte tinción con el colorante, pudiéndose subestimar el contenido de proteínas. Se debería utilizar inmunoglobulina G (IgG) o lisozima, u otro estándar proteico dependiendo del tipo de proteína de la muestra [16].

Entre las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución, los cuales no son compatibles con el ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo de BCA, y la posibilidad de medir proteínas de alto peso molecular ya que el colorante no se une a péptidos de bajo peso molecular [4, 16].

La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con detergentes, los cuales se utilizan de rutina para solubilizar proteínas de membrana. Sólo un nivel de detergente no iónico muy bajo, tal como Triton X-100 a una concentración final de 0,008 % (v/v), puede mejorar la sensibilidad y variabilidad del ensayo de Bradford [17]. Los detergentes pueden ser eliminados por cromatografía de exclusión molecular o por diálisis, lo que lleva a la dilución de la muestra; o por precipitación con fosfato de calcio [16] o acetona, ambos métodos que permiten recuperar como mucho el 70 % de la cantidad inicial de proteína. En una publicación reciente Cheng et al [18] describen un método basado en el ensayo de Bradford que permite la cuantificación de proteínas de manera rápida incluso cuando la solución de proteínas contiene substancias interferentes. El método demuestra una tasa de recuperación de proteínas mejorada después de tan sólo 1 hora de precipitación en acetona posterior a la adición de sacarosa, un componente que no interfiere con el ensayo de Bradford.

Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas (Rango: 10-1000 ug/ml)

El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos reacciones químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas, lo que forma un complejo con los enlaces peptídicos (reacción de Biuret). La segunda, es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, la cual causa un cambio de color a azulado en la solución, con una absorción en el rango de 650 a 750 nm [4]. La cantidad de proteína en la muestra puede ser estimada utilizando una curva de calibración con una solución de una proteína estándar seleccionada, tal como la BSA.

Figura 3. Representación esquemática del ensayo de Lowry.

Las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, y lo más importante, su exactitud. Sin embargo, requiere de más tiempo que otros ensayos, y muchos compuestos comúnmente utilizados en búferes de preparación de proteínas (tales como detergentes, carbohidratos, glicerol, tricina, EDTA, Tris) interfieren con el ensayo de Lowry y forman precipitados (Tabla 3) [4]. No obstante, el efecto de estas substancias puede ser reducido diluyendo la muestra, pero sólo si la concentración de proteínas es lo suficientemente alta [19]. Además, se ha demostrado que el tiempo para realizar este ensayo puede reducirse al aumentar la temperatura o utilizando un horno microondas [19].

Detergentes Compuestos disulfuros
Carbohidratos Fenol
Glicerol Ácido úrico
Tricina Guanina
EDTA Xantina
Tris Calcio y Magnesio
Compuestos de potasio Compuestos sulfidrilos
Tabla 3. Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas: substancias que interfieren.
El ensayo de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) (rango 100 ng-1500 μg /ml)

La 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) es un reactivo fluorogénico sensible utilizado para la detección de aminas en las proteínas. Dado que sólo puede detectar aquellas aminas que se encuentran accesibles en la proteína, este método tiene las mismas limitaciones que los métodos espectrofotométricos para los cuales el resultado depende del número de ciertos aminoácidos en la proteína. Sin embargo, la CBQCA es muy sensible y puede detectar entre 10 ng y 150 microgramos de proteína en un volumen de 100 μl. También, en el lado positivo, el reactivo de CBQCA funciona bien en presencia de substancias como lípidos que se sabe que interfieren en muchos otros métodos de determinación de proteínas [20], o cuando se utiliza para cuantificar péptidos o proteínas ligadas a una superficie o encapsuladas [3].

Ensayo de cuantificación de una proteína específica

Un paso crucial en muchos experimentos es la cuantificación de una proteína específica en solución. Se han utilizado varias técnicas que logran tal cometido. Las más comunes son ELISA, Western blot, y espectrometría de masas. El ELISA y el Western blot se describen en Aplicaciones de anticuerpos, la espectrometría de masas se describe brevemente aquí, y se analiza en el artículo de revisión de Labome Bioanálisis cuantitativo de proteínas por espectrometría de masas.

Espectrometría de masas de proteínas

La espectrometría de masas de proteínas es un método emergente para la cuantificación de proteínas. Un paso importante en el análisis proteómico, además de la caracterización proteica, es la posibilidad de cuantificar una proteína específica. Se han introducido e implementado muchas técnicas para la cuantificación de proteínas por espectrometría de masas. Normalmente, se añaden isótopos estables más pesados de carbono (13C) o nitrógeno (15N) a una muestra (péptidos o proteínas) mientras que sus isótopos ligeros correspondientes (12C and 14N) se añaden a una segunda muestra (estándar interno) que luego se mezclan en el análisis. Debido a la diferencia de masas es posible analizar la relación entre las intensidad de los picos de las dos muestras por un analizador de masas la cual se corresponde con la relación de sus abundancias relativas. Un segundo método para cuantificar proteínas por espectrometría de masas se puede realizar sin marcar las muestras (esto es, con análisis por desorción/ionización láser asistida por matriz, del inglés MALDI). Aquí quisiéramos resaltar la posibilidad de utilizar un método universal como la espectrometría de masas para realizar tanto ensayos cualitativos como cuantitativos en una sola medición. Por ejemplo, recientemente, se han publicado múltiples métodos basados en la espectrometría de masas desarrollados para la cuantificación de proteínas específicas en muestras biológicas . Como ejemplo, sólo algunos del 2016: un método para la cuantificación del factor de crecimiento insulínico 1 en el suero [21], un método para la cuantificación de albúmina en orina [22], y de ubiquinona en suero/plasma [23] ]. En la literatura reciente, podemos encontrar métodos menos específicos para la cuantificación de una proteína en concreto [24-26]. Sin embargo, este método requiere de instrumentación que muchos laboratorios no pueden costear, lo que limita su utilidad [8, 27].

Figura 4. Representación esquemática de la cuantificación de proteínas basada en PQR en células vivas individuales, de [ 28].
Cuantificación de proteínas en células vivas individuales

Ligar la expresión de una proteína de interés a la de un marcador fluorescente a través de un constructo de “marcador para cuantificación de proteína” (del inglés, PQR) [28] puede asegurar una expresión estequiométrica de la proteína y del marcador; por ende, la cantidad de proteína puede deducirse a partir de la intensidad de fluorescencia (Figura 4). Este Esta enlace puede hacerse mediante experimentos de transfección o por edición genómica.

Métodos basados en nanopartículas y nanoporos

Las ya mencionadas limitaciones de los métodos convencionales de cuantificación conducen al desarrollo de nuevas estrategias para la determinación de proteínas en soluciones simples y complejas. Una de las más populares se basa en el uso de nanopartículas, debido a sus propiedades ópticas [29]. Brevemente, una propiedad importante es el cambio de la longitud de onda a la cual absorben luz cuando su tamaño aumenta por la unión a otras moléculas o por agregación [30]. Dado que el cambio de absorción de luz es en el rango visible, el cambio se percibe como un cambio de color. Hasta ahora se han utilizado en conjunto con partículas de unión a proteínas, por ejemplo anticuerpos, péptidos o aptámeros.

Más recientemente, Rogowski et al, propusieron un nuevo tipo de sensores de nanoparticulas para la detección y cuantificación de proteínas, al que llamaron “nariz química” [31]. Su sensor consiste de una mezcla de nanopartículas de oro con diferentes formas que se pueden agregar de diferente manera diferencial cuando interactúan con diferentes proteínas (Figura 5). En base a su espectro de absorción lumínico, las partículas permiten la detección y cuantificación de proteínas purificadas en soluciones acuosas o proteínas no purificadas en soluciones complejas.

Figura 6. Diagrama esquemático de moléculas de ADN portadoras translocando a través de un nanoporo (tal como presentado en [ 32] ) (a); Pico de disminución de corriente causado por la translocación del ADN y caída secundaria indicando ADN “cargado” (b); eventos de translocación del ADN en concentraciones crecientes de proteína (c, d y e).

Un segundo método que ha sido desarrollado recientemente se basa en el uso de nanoporos en estado sólido. Kong et al (2016) [32] utilizaron moléculas largas de ADN como portadoras y nanoporos de vidrio para medir la concentración de proteínas en solución en el rango nanomolar. En este método, las moléculas de ADN, capaces de unir proteínas en sitios específicos, translocan a través de los nanoporos con la ayuda de una corriente eléctrica. Cuando transloca, el ADN causa una caída en la señal de la corriente. Una segunda caída se registra cuando la proteína se une al ADN. Cuanto más alta es la concentración de proteínas, más cargado se encuentra el portador. La frecuencia de los picos de las caídas secundarias de corriente también incrementa con la concentración de proteína (Figura 6).

Ensayos para medir proteínas en la literatura

Labome analizó 250 publicaciones revisadas por pares seleccionadas al azar que citaban ensayos para medir proteínas totales, al 4 de septiembre de 2016. Se identificó que Thermo Fisher Pierce y Bio-Rad Laboratories son los principales proveedores de kits de ensayos para medir proteínas totales (Tabla 4). Los métodos utilizados más frecuentemente son los de BCA y Bradford.

Kaporal Vaqueros para mujer para Kaporal Vaqueros PrSP0qBrax White Vaqueros Sharp Shakira para 99 Skinny Blanco Mujer rqr610Up
Ensayo Núm Proveedor Núm
BCA 140
Thermo Fisher Pierce 112
Sigma 8
Beyotime 2
otros 2
no especificado 10
Bradford 78
Bio-Rad 52
Thermo Fisher Pierce 9
Sigma 1
no especificado< 10
Lowry / ensayo modificado DC 21
Bio-Rad 17
Sigma 1
no especificado 2
Detección UV a 280 nm 12
Thermo Scientific (Nanodrop) 3
no especificado 8
Tabla 4. Estadísticas del análisisbibliográfico sobre los ensayos para medir proteínas totales y sus principales proveedores. Núm es el número de publicaciones que citan el ensayo o el proveedor.
Stowe black Gorro Punto de Adulto Microfibra de Buff Black Ensayo de BCA

Prácticamente todos los ensayos para proteínas totales citados en el grupo de publicaciones revisadas fueron suministrados por Pierce, compañía en donde uno de los científicos inventó el ensayo hace muchos años. Thermo Fisher compró a Pierce hace unos años. Los ensayos de BCA de Thermo Fisher Pierce se utilizaron para estudiar la carcinogénesis tiroidea [33], el rol de VLDLR en la división celular [34], las modificaciones postraduccionales de S100A4 [35], las proteínas humanas RNP H y RNP F como silenciadoras del receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos [36], el mecanismo subyacente al incremento de la actividad StAR y aromatasa en la endometriosis [37], el efecto de la heparanasa en la adhesión y extensión celular [Jacket Herno Mujer Herno Jacket Herno Down Purple Mujer Purple Down Purple Down vPqwS5xZ6], la regulación y el rol de la expresión de NAG-1 en células PC-3 de cáncer de próstata humanos tratadas con VES [39], el rol del receptor de IGF-1 en la función fotoreceptora [40], el rol de Dlx5 en el acoplamiento entre osteoblastos y osteoclastos [41], y en muchos otros [35, 40-108]. Sus kits de micro ensayos de BCA fueron utilizados para estudiar la localización inmunohistoquímica de osteopontina en la glándula de la cáscara del huevo, y en la cáscara del huevo de aves [109], para estudiar la recuperación tras el daño por impacto cortical controlado en ratas [110], y la localización en membrana de la nucleoproteína del virus de la hepatitis C y la propagación del virus [111] y otros [112].

También se citaron el reactivo de BCA de Sigma [113] y el kit de BCA de Bio-Rad también fueron citados.

Ensayo de Bradford

Thermo Fisher Pierce también es uno de los principales proveedores de kits de ensayos de Bradford. Los kits de ensayos de Coomassie/Bradford de Pierce se utilizaron para evaluar la expresión de la proteína chaperona ERp29 [114], el rol de YKL-40 en la modulación de la actividad biológica del factor de crecimiento de fibroblastos básico [115], entre muchos otros tópicos de investigación [85, 99, 116-122].

Los reactivos de ensayos de Bradford de Bio-Rad fueron citados en numerosas publicaciones [123-155].

Otros proveedores también proporcionaron kits de ensayo de Bradford, por ejemplo, Sigma [156, 157] y Expedeon [158].

Ensayo de Lowry

El ensayo de Lowry de Pierce (número de catálogo 23240) se utilizó para cuantificar la concentración de proteínas [159] y el de Bio-Rad Laboratories fue utilizado en [160] y [161]. El ensayo de proteínas totales DC de Bio-Rad es una versión modificada del ensayo de Lowry. Es uno de los ensayos más populares para proteínas dado que es compatible con detergentes. Este kit ha sido utilizado para determinar la concentración de proteínas para estudiar la estructura y función de la tetraspanina humana CD81 [162], el efecto de la ablación específica en músculo esquelético de la gamma citoactina en el fenotipo mdx [159], entre otros [56, 163-174].

Preguntas frecuentes
¿Es BSA un buen estándar?

El mejor estándar para la cuantificación de una proteína es la misma proteína que se está cuantificando. Sin embargo, esto es improbable en la mayoría de los casos. BSA (albúmina sérica bovina, por sus siglas en inglés) es el estándar de proteínas utilizado más frecuentemente. Tiene limitaciones. En el ensayo de Bradford es más sensible que otras proteínas, y por tanto la concentración de las proteínas en la muestra probablemente sean subestimadas [175]. Además, la ASB , como proteína sérica, no puede ser obtenida/preparada con gran pureza, ya que se une a muchos otros factores. Otras proteínas, tales como la inmunoglobulina G y la lisozima también han sido utilizadas como estándares de proteínas.

La medición de mi muestra se encuentra fuera del rango de la curva de calibración, ¿se puede extrapolar la curva de calibración?

Buff Punto Microfibra de Adulto Black Gorro Stowe de black No. Es de suma importancia que las mediciones caigan dentro del rango de la curva de calibración. Se debe ajustar la dilución de la muestra o de la ASB, o de ambos.

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